Thông tin chung:

Ngày nhận: 23/04/2016

Ngày chấp nhận: 26/10/2016

Title:

Rapid detection of Streptococcus agalactiae and Streptococcus iniae from fish tissue by duplex polymerase chain reaction

Từ khóa:

Mô cá, PCR, phát hiện, Streptococcus agalactiae, Streptococcus iniae

Keywords:

Detection, fish tissue, PCR, Streptococcus agalactiae, Streptococcus iniae

ABSTRACT

This research was conducted to develop a duplex PCR assay that could simultaneously detect Streptococcus agalactiae and Streptococcus iniae, two causative agents of Streptococcosis on both of freshwater and brackishwater fish. The duplex-PCR amplified partial lactate oxidase (lctO) and 16s rRNA genes of S. iniae and S. agalactiae at 870 bp and 220 bp, respectively. Results showed that (i) the PCR reaction consists of the following components 1 X PCR buffer; 2 mM MgCl₂; 250 µM dNTPs; 10 pm F1 and IMOD primers; 5 pm LOX-1 and LOX-2 primers; 1,0 U Taq polymerase, 1 μl S. agalactiae extracted DNA; 1 μl S. iniae extracted DNA, total reaction volume of 25 µl and (ii) the PCR cycle consists of 95^oC for 5 min, followed by 35 cycles of 95^oC for 1 min, 57^oC for 1 min, 72^oC for 1 min, and a final elongate step at 72^oC for 7 min. The detection limits of the duplex PCR were in the range of 10⁰ cfu/ml and 10³ cfu/ml for S. agalactiae and S. iniae, respectively. The duplex PCR did not produce any specific amplification products when tested against Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila, Vibrio harveyi và Vibrio parahaemolyticus.

TÓM TẮT

Nghiên cứu thực hiện nhằm phát triển quy trình duplex PCR phát hiện đồng thời hai loài vi khuẩn S. agalactiae và S. iniae gây Streptococcosis trên cá nước ngọt và mặn. Quy trình khuếch đại sản phẩm dựa trên các gen lactate oxidase (lctO) và 16s rRNA của S. iniae và S. agalactiae tương ứng tại 870 bp và 220 bp. Nghiên cứu xác định được: (i) thành phần hóa chất phản ứng bao gồm: 1 X PCR buffer; 2 mM MgCl₂;250 µM dNTPs; 10 pm mồi F1; 10 pm mồi IMOD; 5 pm mồi LOX-1; 5 pm mồi LOX-2; 1,0 U Taq polymerase; 1 µL DNA S. agalactiae chiết tách; 1 µL DNA S. iniae chiết tách, tổng thể tích phản ứng là 25 µL và (ii) chu kỳ nhiệt cho phản ứng duplex PCR: 95^oC trong 5 phút, tiếp theo 35 chu kỳ: 95^oC trong 1 phút, 57^oC trong 1 phút, 72^oC trong 1 phút và cuối cùng 72^oC trong 7 phút. Độ nhạy của quy trình được xác định đối với S. agalactiae là 10⁰ cfu/mL và S. iniae là 10³ cfu/mL. Qui trình duplex PCR không khuếch đại sản phẩm đặc hiệu khi kiểm tra với Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila, Vibrio harveyi và Vibrio parahaemolyticus.

Trích dẫn: Trần Thị Tuyết Hoa, Nguyễn Trang Huyền và Hồng Mộng Huyền, 2016. Phát hiện nhanh Streptococcus agalactiae và Streptococcus iniae từ mẫu mô cá bằng kỹ thuật duplex PCR. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 46b: 111-117.